定义和原理

PCR 即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术。其原理是以拟扩增的 DNA 分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的 DNA 合成，重复这一过程，就可以使目的 DNA 片段得到大量扩增。

主要步骤

变性：将双链 DNA 加热至 90 - 95℃，使双链 DNA 解开成为单链，这一过程破坏了 DNA 双链之间的氢键，为后续的引物结合提供单链模板。例如，在检测新冠病毒核酸时，首先要将病毒的 RNA 通过逆转录得到 cDNA，然后将 cDNA 进行变性处理。

退火：将温度降低至 50 - 65℃左右，使引物与单链 DNA 模板上的互补序列结合。引物是人工合成的短链 DNA，其长度一般在 18 - 30 个核苷酸左右，它们能够特异性地识别并结合到目标 DNA 片段的两端。退火温度的选择取决于引物的长度和序列组成，合适的退火温度可以保证引物与模板的特异性结合。

延伸：将温度升高到 72℃左右，在 DNA 聚合酶（如 Taq 酶）的催化下，以 dNTP（脱氧核糖核苷酸）为原料，从引物的 3' 端开始，按照碱基互补配对原则，逐个添加核苷酸，使引物沿着模板链延伸，合成新的 DNA 片段。Taq 酶是一种热稳定的 DNA 聚合酶，它在高温下仍能保持活性，这使得 PCR 反应能够反复进行多轮。

反应体系的组成成分

模板 DNA：这是 PCR 反应的起始物质，包含了需要扩增的目标 DNA 序列。模板可以来自各种生物样本，如血液、组织、细胞、细菌、病毒等。例如，在遗传病的基因诊断中，从患者的血液细胞中提取基因组 DNA 作为模板；在病原体检测中，从感染组织或体液中提取病原体的核酸作为模板。

引物：是一小段单链 DNA，能够与模板 DNA 的特定区域互补结合，决定了 PCR 扩增的起始位置和特异性。引物的设计需要考虑多种因素，如长度、GC 含量、避免二级结构等。通常一对引物用于扩增一个特定的 DNA 片段，上下游引物分别与模板 DNA 的两条链互补。

DNA 聚合酶：如 Taq 酶，它是 PCR 反应的关键酶，能够催化 DNA 链的延伸。Taq 酶具有热稳定性，在高温变性步骤后仍能保持活性，使得 PCR 反应能够在不同温度循环下顺利进行。除了 Taq 酶，还有其他一些具有更高保真度或特殊功能的 DNA 聚合酶可供选择，用于不同的实验目的。

dNTPs：即脱氧核糖核苷酸（包括 dATP、dCTP、dGTP 和 dTTP），是合成新 DNA 链的原料。它们在 DNA 聚合酶的作用下，按照模板链的碱基序列逐个添加到引物的 3' 端，形成新的 DNA 链。dNTPs 的浓度会影响 PCR 反应的效率和产物的质量，一般在反应体系中的浓度相对稳定。

缓冲液：为 PCR 反应提供适宜的 pH 值和离子强度等反应条件。缓冲液中通常含有 Tris - HCl（维持 pH）、KCl（提供离子强度）和 Mg2?（是 DNA 聚合酶的激活剂）等成分。Mg2?浓度对 PCR 反应的特异性和效率有重要影响，过高或过低的 Mg2?浓度可能导致非特异性扩增或扩增效率低下。

类型

常规 PCR：用于扩增特定的 DNA 片段，以获得足够量的 DNA 用于后续的分析，如基因克隆、测序、基因表达研究等。例如，在基因克隆过程中，通过常规 PCR 扩增目的基因，然后将扩增产物插入到载体中构建重组 DNA。

实时荧光定量 PCR（qPCR）：在 PCR 反应体系中加入荧光基团，通过检测荧光信号的变化来实时监测 PCR 反应过程中的 DNA 扩增情况，并且可以对起始模板 DNA 的量进行定量分析。这种方法广泛应用于基因表达水平的定量研究、病原体核酸定量检测等领域。例如，在病毒载量检测中，qPCR 可以精确地测量血液中病毒核酸的含量，为疾病的诊断和治疗提供重要依据。

逆转录 PCR（RT - PCR）：主要用于扩增 RNA 模板。由于 DNA 聚合酶不能直接以 RNA 为模板进行扩增，所以首先要通过逆转录酶将 RNA 逆转录为 cDNA，然后再进行常规的 PCR 扩增。RT - PCR 常用于检测细胞中的 mRNA 表达水平，以研究基因在转录水平的调控。例如，在研究细胞在不同刺激下某个基因的表达变化时，通过 RT - PCR 检测 mRNA 的量来反映基因的表达情况。

巢式 PCR：使用两对引物进行两轮 PCR 扩增。第一轮 PCR 使用一对外部引物扩增出包含目的 DNA 片段的较大片段，第二轮 PCR 以第一轮 PCR 产物为模板，使用一对内部引物（位于第一轮引物内部）进行扩增，得到更特异的目的 DNA 片段。这种方法可以提高 PCR 反应的特异性和灵敏度，常用于检测低拷贝数的模板或复杂样本中的目标基因。例如，在检测一些痕量病原体核酸或古代 DNA 样本时，巢式 PCR 能够有效提高检测的成功率。

应用领域

医学诊断：用于检测病原体核酸，如病毒（流感病毒、新冠病毒等）、细菌（结核杆菌、幽门螺杆菌等）、寄生虫（疟原虫等），是感染性疾病诊断的重要手段。同时，也用于遗传病的基因诊断，通过检测基因突变来确定疾病的类型和携带者。例如，在产前诊断中，PCR 技术可以检测胎儿是否携带某些遗传性疾病的突变基因。

法医学鉴定：在犯罪现场勘查和亲子鉴定等方面发挥关键作用。通过对现场遗留的血液、毛发、精液等生物样本中的 DNA 进行 PCR 扩增和分析，可以确定个体身份或亲缘关系。例如，在亲子鉴定中，比较孩子与父母的某些特定基因位点的 DNA 序列，通过 PCR 技术进行扩增和比对，计算亲权指数，从而判断亲子关系。

分子生物学研究：是基因克隆、基因表达分析、基因功能研究等的基础技术。例如，在研究基因功能时，通过 PCR 扩增目的基因，构建基因敲除或过表达载体，然后将其导入细胞或生物体中，观察基因改变后的表型变化。同时，PCR 技术也用于 DNA 测序的样本制备，为基因组学研究提供大量的 DNA 样本。

农业和食品科学：在转基因生物检测、动植物品种鉴定、食品微生物检测等方面有广泛应用。例如，检测农产品是否为转基因产品，通过 PCR 检测特定的转基因元件来判断；在食品微生物检测中，快速检测食品中的有害细菌或病毒，保障食品安全。