定义和原理
ELISA 即酶联免疫吸附测定（Enzyme - Linked Immunosorbent Assay），是一种将抗原 - 抗体反应的特异性与酶对底物的高效催化作用相结合的一种高灵敏度的检测技术。其基本原理是：抗原或抗体能吸附至固相载体表面，并保持其免疫活性；抗原或抗体与酶结合后，既不改变抗原或抗体的免疫反应活性，也不影响酶的活性。在检测时，将待检样本（含有抗原或抗体）加入到已包被有对应抗原或抗体的微孔板中，进行孵育，使抗原 - 抗体发生特异性结合。然后加入酶标记的二抗，再次孵育，形成 “包被抗体 - 抗原 - 酶标二抗” 的复合物。最后加入酶的底物，酶催化底物发生反应，产生有色产物，通过酶标仪测定吸光度（OD 值），吸光度的大小与待检样本中抗原或抗体的含量呈正比。
主要类型
间接 ELISA
用于检测样本中的抗体。首先将已知抗原包被在微孔板表面，然后加入待检血清，血清中的抗体（一抗）与包被抗原结合。洗涤后，加入酶标记的二抗，二抗能与一抗特异性结合。最后加入底物显色，通过测定吸光度来判断样本中抗体的含量。例如，在检测传染病（如乙肝病毒抗体）时，可采用间接 ELISA 法，通过这种方法可以确定个体是否感染过乙肝病毒以及是否产生了相应抗体。
直接 ELISA
用于检测样本中的抗原。将特异性抗体包被在微孔板上，加入待检样本，样本中的抗原与包被抗体结合。洗涤后，直接加入酶标记的抗体（与包被抗体为同一抗体），再次洗涤后加入底物显色。直接 ELISA 操作相对简单，但灵敏度可能不如间接 ELISA。它适用于检测一些抗原含量较高的样本，如在食品检测中，检测牛奶中的特定蛋白质抗原可以使用直接 ELISA。
夹心 ELISA
主要用于检测样本中的抗原。它利用两种针对同一抗原不同表位的抗体，先将一种抗体（捕获抗体）包被在微孔板上，加入待检抗原，抗原与捕获抗体结合。洗涤后，加入另一种酶标记的抗体（检测抗体），形成 “抗体 - 抗原 - 酶标抗体” 的夹心结构。最后加入底物显色，通过吸光度判断抗原含量。夹心 ELISA 的灵敏度和特异性都较高，常用于检测生物样本中的低浓度抗原，如检测细胞因子、肿瘤标志物等。
操作步骤
包被：将抗原或抗体吸附在微孔板的孔壁上，一般通过物理吸附（如静电引力）或化学交联的方式进行。包被液的选择、包被的温度和时间等条件都会影响包被的效果。例如，常用的包被液有碳酸盐缓冲液（pH 9.6），在 4℃下过夜包被可以使抗原或抗体较好地吸附在微孔板表面。
封闭：包被后，微孔板表面可能还存在一些未被抗原或抗体占据的活性位点，需要用封闭液进行封闭，以减少非特异性吸附。常用的封闭剂有牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉等。封闭的时间和温度也需要根据具体情况进行优化，一般在 37℃下封闭 1 - 2 小时。
加样：将待检样本（血清、细胞上清液等）加入到已封闭的微孔板中，同时设置标准品和阴性对照。在适当的温度（如 37℃）下孵育一定时间（如 1 - 2 小时），使抗原和抗体充分结合。
洗涤：孵育后，需要将未结合的物质洗去，以减少非特异性背景。通常使用含有吐温 - 20 的磷酸盐缓冲液（PBST）进行洗涤，一般洗涤 3 - 5 次，每次洗涤后要尽量将液体甩干。
加酶标抗体：加入酶标记的抗体，再次孵育和洗涤，操作方法与前面的加样和洗涤步骤类似。酶标抗体的种类根据检测的抗原或抗体以及 ELISA 的类型而不同，常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
显色：加入酶对应的底物，酶催化底物发生反应，产生有色产物。例如，HRP 常用的底物是四甲基联苯胺（TMB），反应后会产生蓝色产物，在酸性条件下会变为黄色。显色的时间和温度要根据酶和底物的特性来确定，一般在 37℃下显色 10 - 30 分钟。
终止反应和读板：当显色达到合适程度时，加入终止液（如硫酸）终止反应。然后使用酶标仪在特定波长下读取吸光度值，根据标准曲线计算出样本中抗原或抗体的含量。
应用领域
医学诊断
ELISA 广泛用于检测各种病原体感染，如检测艾滋病病毒（HIV）抗体、梅毒螺旋体抗体等，是疾病诊断和筛查的重要手段。同时，它还用于检测自身免疫性疾病的相关抗体，如抗核抗体（ANA）用于系统性红斑狼疮的诊断，类风湿因子（RF）用于类风湿关节炎的诊断等。此外，ELISA 还可以检测肿瘤标志物，如甲胎蛋白（AFP）用于肝癌的辅助诊断，癌胚抗原（CEA）用于结肠癌等多种癌症的检测。
生物医学研究
在基础研究中，ELISA 用于检测细胞培养上清液中的细胞因子（如白细胞介素、干扰素等），以研究免疫反应、炎症反应等细胞间的信号传递过程。它还可以用于检测蛋白质的表达和相互作用，例如，在研究蛋白质 - 蛋白质相互作用时，可以通过 ELISA 检测一种蛋白与另一种蛋白的结合情况。
食品安全检测
ELISA 可用于检测食品中的有害物质，如检测牛奶中的黄曲霉毒素、肉类中的兽药残留（如氯霉素）等。同时，它也可以检测食品中的过敏原，如花生蛋白、牛奶蛋白等，对于保障食品安全和预防食物过敏具有重要意义。
环境监测
用于检测环境样品中的污染物，如检测水中的农药残留、重金属离子的蛋白结合物等。通过 ELISA 可以快速、灵敏地监测环境中的有害物质，为环境保护提供数据支持。